アガロースゲル電気泳動、その仕組みとその用途

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単純な物理法則によれば、荷電種を含む媒体に電流が印加されると、それらの種は反対の電荷に向かって移動します。 移動する媒体によっては、存在する種の大きさなどの他の特徴が移動に影響を及ぼし、分離につながる可能性があります。 これは、アガロースゲル電気泳動などの電気泳動技術が構築される基礎であり、ライフサイエンス全体で広く使用されている技術です。

この記事では、アガロースゲル電気泳動がどのように機能するか、どのように解釈できるか、およびその目的のいくつかについて考察します。

電気泳動は、電流を使用して、サイズや電荷などの物理的特性に基づいて DNA、RNA、またはタンパク質を分離する技術です。

アガロースゲル電気泳動は、サイズに基づいて核酸 (DNA または RNA) フラグメントを分離するために使用される電気泳動の一種です。 負に帯電した DNA/RNA は、電流が印加されるとアガロース ゲルの細孔を通ってゲルの正に帯電した端に向かって移動し、より小さなフラグメントほどより速く移動します。 結果として得られるバンドは、紫外線 (UV) 光を使用して視覚化できます。

ただし、RNA 1 は、移動方法に影響を与える二次構造 (同じフラグメントに対して複数の異なる種が存在する場合もあります) を形成する傾向があります。 そのため、観察されるバンドは必ずしも実際のサイズを表しているわけではなく、画像がぼやけてしまいます。 したがって、ネイティブアガロースゲル (分析対象物の自然な構造が破壊されない条件) は、量と完全性の推定値は得られますが、RNA サイズの分析には使用されない傾向があります。 代替方法には、二次構造を破壊できる条件を使用するノーザンブロット法や変性アガロースゲル電気泳動 2 などがあります。

アガロースゲルは、サイズと電荷に基づいてタンパク質 3 を分離するために使用することもできます (DNA/RNA とは異なり、タンパク質は取り込まれたアミノ酸に応じて電荷が異なります)。 ただし、アガロースゲルの細孔サイズは大きいため、タンパク質は多くの場合、より小さな細孔を備えたポリアクリルアミドゲルで分離され、小さなタンパク質分子の分解能が向上します。

したがって、この記事の残りの部分では DNA アガロースゲル電気泳動に焦点を当てます。

アガロースは寒天の成分です。 それは、分子が通過できるチャネルと細孔を備えた、水素結合によって保持されたスーパーコイル状の束の中にらせん状アガロース分子の 3D ゲル マトリックスを形成します。 加熱すると、これらの水素結合が壊れ、アガロースが液体になり、リセットされる前に型に注ぐことができるようになります (図 1)。

ゲルに含まれるアガロースの割合は、細孔のサイズに影響を与え、したがって通過する分子のサイズとその速度に影響を与えます。 アガロースのパーセンテージが高くなるほど、細孔サイズが小さくなり、通過できる分子が小さくなり、移動が遅くなります。 分子生物学研究室では、通常、日常の DNA 分離に 0.7 ～ 1% アガロースゲルが使用され、0.2 ～ 10 kb の範囲の断片を良好かつ明確に区別できます。 より大きなフラグメントは、より低いパーセンテージのゲルを使用して分離できますが、非常に壊れやすく、取り扱いが困難になります。一方、より高いパーセンテージのゲルは、小さなフラグメントのより良好な分離を提供しますが、脆く、不均一に固まる可能性があります。

ゲル電気泳動は、DNA、RNA、タンパク質などの生体高分子の混合物を分離するために使用されます。 この技術は、分子サイズおよび/または電荷によって分離します。 これは、電場を使用して小さな細孔を含むゲルを通して分子を引き込むことによって実現されます。

DNA は肉眼では見えないため、硬化中に臭化エチジウム (EtBr) などの挿入色素がゲルに組み込まれます。 これは DNA に結合し、UV 光の下で蛍光を発し、DNA 断片を視覚化できるようになります。 存在する DNA が多いほど、バンドは明るくなります。